ApoE基因多态性测序检测与阿尔茨海默病相关性研究（范文推荐）

时间：2022-09-06 08:15:06 来源：网友投稿

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　ＡｐｏＥ基因多态性的测序检测与阿尔茨海默病的相关性研究朱长乐赖仁胜谢玲李慧（南京中医药大学附属医院病理科／分子生物学实验室，江苏南京２１００２９）【摘要】目的探讨载脂蛋白Ｅ（ｐ，ｐｏＥ）基因多态性分布及其与阿尔茨海默病（Ａｌｌｄａｅｉｍｅｒｄｉｍ，ＸＯ）的关系。

　方法采用基因测序法对２１２例心脑血管疾病患者和１２６例健康对照组进行ＡｐｏＥ基因多态性测定，观察其分布情况以及与ＡＤ患者的相关性进行分析。

　结果正常人群ｅ３／８３、８２／ｅ３、６４／８４基因型比例分别为７３．０％、１２．７％、０．８％，ＡＤ组和对照组含“等位基因分别为４８％、１２．７％，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。

　结论ＡｐｏＥｅ３／６３基因型是正常人群的主要形式，ＡｐｏＥ８４等位基因是ＡＩ）的风险基因之一，与ＡＤ的发病呈显著性相关。【关■词】

　基因测序；载脂蛋白Ｅ；基因多态性；阿尔茨海默病［中圈分类号】

　１１７４９．１＋６（文ｌ哇标识码）Ａ［文章■号】

　１００Ｓ－９２０２１２００７１２，３－２３Ｕ－０２载脂蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）在脂蛋白代谢相关疾病中起重要作用¨ 】

　。

　研究表明，ＡｐｏＥ多态性与阿尔茨海默病（ＡＤ）发病密切相关∞－３】

　。

　国内ＡｐｏＥ基因多态性检测多用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ —ＲＦＬＰ等方法，制备凝胶耗时长。

　操作过程及判定结果非常复杂Ｈ】

　，而用直接测序方法大批量检测鲜有报道。

　本文应用基因测序方法进行ＡｐｏＥ基因多态性检测，进一步探讨ＡｐｏＥ基因多态性频率分布及其与ＡＤ发病的关系，为ＡＤ的防治研究提供资料。１材料与方法１．１材料血液标本取自２００４年８月至２００６年１１月问我院神经内科、心内科、老年科住院和门诊心脑血管疾病患者２１２例及体检对照组１２６例（男２００例，女１３８例），年龄２７一跖（平均６３．５４，４－１０．９２）岁，均为汉族，研究对象之间无血缘关系。

　其中，心脑血管疾病组包含ＡＤ患者２５例，符合美国ＤＳＩ－Ｉ一Ⅳ中ＡＤ的临床诊断标准，并结合临床神经功能测试结果作为诊断ＡＤ的依据。１．２主要仪器与试剂美国ＡＢＩ３１００・ＡｖａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ遗传分析仪、ＡＢＩＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２７００、Ｐｒｏｍｅｇａ公司Ａ１１２０基因组Ｉ）Ｉ、ＩＡ提取试剂盒、Ｑｉａｇｅｎ公司ＨｏｔＳｔａｒｌ＇ａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ及ＡＢＩＢｉ９１）ｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ｌ（ｉｔ测序试剂盒（Ｐａｒｔ．Ｎｏ４３３６９１７）。１．３方法１．３．１引物及ＰＣＲ扩增产物ＡｐｏＥ基因上游引物：

　５’ －ＡＣ，ＧＧＴＣＣＴＧＡ。

　ｍＧＡＣＧＡＧＡＣ－３’ ，下游引物：

　５’ －Ｃ，ＣＴＣＡｃＣ，ＧＡ＇ＩＶ，ＧＴＧＣＴＧＡＧＧ－３’ ，由上海生物工程公司合成。

　特异性扩增ＡｐｏＥ基因第四外显子区含编码１１２位与１５８位氨基酸的基因序列，产物片段３５８ｂｐ。１．３．２基因组ＤＮＡ提取及ＰＣＲ扩增条件的建立取受检对通讯作者：

　赖仁胜（１９５１・），男，主任医师．博士生导师，主要从事临床病理及基因测序研究。作者简介：

　朱长乐（１９６９・），男，主管技师，主要从事病理免疫组化及基因测序研究。象静脉血２ｌｎｌ，肝索抗凝处理，提取ＤＮＡ，一１８ ℃保存备用。２０ —ＰｃＲ反应体系：

　１０ＸＰＣＲ缓冲液（含１５ｍｍｏｌ／ＬＩＶｌｇｃｌ２）２一，ｔｌｏｔＳｔａｒＴａｑＤＮＡ多聚酶０．２一，５× Ｑ一溶液４一，ｄＮＴＰ混合物（各１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２山，上下游引物各ｌ一，模板Ｉ）ＮＡ１山，蒸馏水８．８ｍ。

　ＰｃＲ反应条件：

　９５℃ 预变性１５ｍｉｎ，用降落ＰＣＲ技术，９４ ℃ 变性５０Ｂ，６３℃一５８ ℃退火１ｍｉｎ（一０．５℃／１ＩＩＩｉｎ），７２℃延伸ｌｍｉｎ，循环１０次；９４＂Ｃ变性５０８，５７ ℃退火１ｒａｉｎ。

　７２＂Ｃ延伸１ｍｉｎ，循环３０次，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。１．３．３ＰＣＲ产物纯化及测序用１．５％琼脂糖凝胶电泳观察ＰｃＲ扩增产物是否为单一目的条带，用Ｖ＇ｏｇｅｎｅ公司ＰＣＩｌ产物纯化试剂盒，过柱纯化后进行测序反应。

　１０一反应体系：

　１一ＢｉｇＤｙｅ＋１．５出１３ｉ９１）ｙｅ测序缓冲液＋３一上游引物＋１一ＰＣＲ纯化产物＋３．５心ｄｄｔｔ２０。

　测序ＰｃＲ热循环条件．９６ｑＣ，１０ｓ一（９６℃ｌＯ ¨ ５０℃５ｓ＿６０ ℃ ４Ｉｎｉｎ）× ２５个循环－＋６０ ℃，４ｍｉｎ—＋４ ℃保温，测序ＰＣＲ产物经纯化后上样至ＡＢＩ３１００－Ａｖａｎｔ遗传分析仪进行电泳。１．３－４ＡｐｏＥ基因型鉴定根据ＡｐｏＥ基因第４外显子序列１１２和１５８位密码子碱基的不同组合，确定６种不同的基因型（表１）。表ｌ不罔基因型１１：

　Ｚ、１５８位密码子序列Ｌ４统计学方法计算ＡｐｏＥ基因型及等位基因的频率，采用ｓＰｓＳ１２．０统计分析软件对基因多态性与ＡＤ发病率进行，检验分析其相关性。２结果幺ｌＡｐｏＥ基因型和等位基因频数分布共检测到６种不同的基因型。

　３种纯合子：

　ｅ２／８２型３例。

　ｅ３／ｅ３型２１９例，ｅ４／ｅ４型６例，３种杂合子８２／ｅ３型４３例，８２／８４型６例，８３／８４型６２例。

　见表２。Ｚ２不同性别ＡｐｏＥ基因型的分布两组中男、女的ＡｐｏＥ基　　万方数据

　因型分布无差异见表３（ｐ＝Ｏ．３６８，Ｐ＞Ｏ．０５）。

　提示ＡｐｏＥ基因型和等位基因频数分布与性别无关。裹２不同组别的ＡｐｏＥ基因型的分布（矗（％）］组别ｎＢ２／Ｂ２ｅ３／ｅ３ｓ４／ｅ４ｅ２／ｅ３ｅ２／ｅ４ｅ３／ｅ４心脑血管组２１２１（０．５）１２７（５９．９）５（２．４）２７（１２．７）４（１．９）４８（２２．６）健康对照组１２６２（１。

　６）９２（７３．Ｏ）１（ｏ ‘８）１６（１２．７）２（１．６）１３（１０．３）表３不同性别ＡｐｏＥ基因型的分布［一（％））基因型ｎ８２／８２Ｂ３／ｅ３ｅ４／８４８２／ｅ３ｓ２／ｅ４８３／ｅ４男２００２（１．０）１２９（６４．５）２（１．Ｏ）２８（１４．０）５（２．５）３４（１７．０）女１３８ｌ（Ｏ．７）８８（６３．８）５（３．６）１５（１０．８）１（０．７）２８（２０．３）２．３ＡＤ组及对照组ＡｐｏＥｅ４等位基因比较根据ＡｐｏＥ基因分为ｅ４等位基因携带者（包括ｅ２／ｅ４．、ｓ３／ｅ４、彬８４）和非８４等位基因携带者（包括ｅ２／ｅ２、ｅ２／ｅ３、ｅ３／ｅ３），将２５例ＡＤ患者与对照组进行比较分析见表４。

　８４基因携带者ＡＤ组与对照组比较，具有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。裹４ＡＤ组和对照组含８４等位基因比较［厅（％））与对照组比较：

　１）Ｐ（Ｏ．０１３讨论３．１ＡｐｏＥ基因多态性检测及其频率分布ＡｐｏＥ基因位于第１９号染色体（１９ｑ１３．２）上，基因全长为３．７ｋｂ，由４个外显子和３个内含子组成。

　３个常见等位基因８２、８３、８４分别编码３种异构体，即ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４。

　其遗传多态性主要受位于同一基因位点上的３个等位基因所控制，分别编码血浆中３种异构体，构成６种不同的基因型。

　其生理功能主要为参与胆固醇的转运及血浆脂蛋白的代谢，同时还具有神经元修复、树突生长、维持突触可塑性以及抗炎等作用。

　目前关于ＡｐｏＥ表型和基因型的检测方法很多，包括等电聚焦电泳、免疫印迹法、双相电泳法、ＰＣＲ・ＲＦＬＰ和ＰＣＲ・ＳＳＣＰ等。

　我们通过基因测序法检测ＡｐｏＥ基因多态性，成功率达９９％以上，认为该方法更为精确、快速、可靠，具有可以全序列、逐碱基判读ＡｐｏＥ基因，且漏检率低、重复性好等特点。

　本组实验１２６例健康人群中８３／ｅ３基因型为７１．４％，ｅ３／“基因型为１２。

　６％，ｅ４／ｅ４基因型为０．８％，与文献报道基本一致” ，６】

　。３．２ＡｐｏＥ基因多态性与ＡＤ病的关系ＡＤ是最常见的一种老年性痴呆，以进行性记忆和认知功能障碍为主要临床特征。到目前为止，ＡＤ的发病确切机制尚未完全清楚，普遍认为多个基因和多个环境因素以及它们之间复杂的相互作用在ＡＤ的发病过程中起着重要的作用。

　研究发现。

　ＡＤ的发病与ＡｐｏＥ的基因多态性密切相关，ＡｐｏＥ广泛参与ＡＤ发病的各个方面，包括Ｂ样淀粉蛋白（ＡＢＰ）的沉积、Ｔａｕ蛋白的异常磷酸化、神经纤维缠结（ＮＦＴ）的形成、神经变性以及精神和行为缺陷等。研究表明， “等位基因与迟发性家族性ＡＤ和散发性ＡＤ相关，被认为是ＡＤ发病的易患基因之一，而￡２等位基因则对此类疾病具有防护作用ｏＬ８１。

　把人ＡｐｏＥ３基因转入敲除ＡｐｏＥ的小鼠体内，发现ＡｐｏＥ３的转基因小鼠对年龄依赖型和兴奋剂毒剂诱发的神经退化具有防护作用。

　而ＡｐｏＦＡ的转基因小鼠则没有这种作用，ＡｐｏＥ３／４的转基因小鼠也易于发生神经退化。

　因此，ＡｐｏＥ４作为一种负向调控因子干扰ＡｐｏＥ３的保护作用，抑制ＡｐｏＦＡ活性有利于预防和治疗ＡＰＯＦＡ携带者的神经退化性疾病归’ 。

　本组实验中，２５例ＡＤ患者有１２例为８４基因携带者（４８．Ｏ％），而正常人群仅占１２．７％，说明８４等位基因与ＡＤ的发病具有相关性（Ｐ＜０．０１）。

　性别分布无差异（Ｐ＞ｏ．０５）。

　另外，２１２例心脑血管患者携带ｅ４等位基因比例达２５．９％，亦高于正常对照组，提示ＡｐｏＥｅ４基因型与心脑血管疾病的发生有关。

　其机制可能与８４等位基因使血浆中胆固醇增高，从而导致不同程度的心脑血管症状。综上所述，８３／８３是正常人群ＡｐｏＥ基因的主要形式，占７３．Ｏ％，其次ｅ２／ｅ３为（１２．７％）和８３／８４（１０．３％），ｅ２／ｅ２、ｅ２／８４、８４／８４基因型较少见。

　本研究结果阐明ＡｐｏＥ８４和ＡＤ发病有一定关联，是风险基因之一。

　但其致病机制、与其他因素的相互作用等方面，有待进一步研究。

　同时，ＡｐｏＥｅ４基因型也是心脑血管疾病的重要发病内因，ＡｐｏＥ基因多态性检测可作为临床应用来预测老年性痴呆发病的可能概率，对老年性痴呆后期发病预测有较高的准确性，特别是家族性受检者。

　ＡｐｏＥ基因多态性的检测尽管还不能作为一个独立的诊断依据，但作为心脑血管疾病的危险因子正被许多学者所公认。４参考文献１ＥｖａｎｓＲＭ，ＨｕｉＳ，ＰｅｒｋｉｎｓＡ，ｅｔ吐Ｃｈｏｌ∞ｔｅｍｌａｎｄＡＰＯＥｇｅｎｏｔｙｐｅｉｎｔｅｒ－ａｃｔｔｏｉｎｆｌｕｅｎｃｅＡｌｚｈｅｉｍｅｒｄｉｓｅａｓｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００４；６２（１０）：

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